顾青:核糖开关用于检测发酵食品维生素B12

 

维生素B12作为水溶性微生物,又叫钴胺素,是唯一含金属元素钴的维生素。在人体生长代谢过程中,维生素B12可参与制造骨髓红细胞,防止恶性贫血;防止大脑神经受到破坏,因此对于食品中维生素B12的检测尤显得重要。

传统方法中,食品维生素B12含量通过微生物检测(MA)获得,其分析方法的灵敏度优异,但选择性差,劳动强度大,耗时长,此外,由于食品中含有脱氧核糖核苷酸和其他类胡萝卜素,分析结果会高于实际维生素B12含量。近几年核糖开关的应用越发广泛,它是指mRNA一些非编码区的序列折叠成一定的构象,这些构象的改变应答于体内的一些代谢分子,从而通过这些构象的改变达到调节mRNA转录的目的。本文将核糖开关应用于检测维生素B12,通过腺苷钴胺直接结合核糖开关区域,导致mRNA二级结构的构象发生变化,从而抑制表达。在这个过程中,绿色荧光蛋白的表达与腺苷钴胺素的浓度呈现负相关。

图1. 核糖开关质粒构建示意图

在该实验中,将费氏丙酸杆菌DSM 20270中获取的核糖开关通过酶切连接到质粒p519ngfp上(如图1)。核糖开关通过结合钴胺素,抗隔离子(Antisequestor)与P3(CCCC)适体结构域形成假结,此时抗隔离子补体与RBS形成发夹结构(如图2),终止转录过程的进行。对此进行了验证实验(如图2),随着钴胺素浓度升高,抑制gfp的表达加强,其荧光表达减弱。

图2. 核糖开关质粒构建示意图及效果验证

之后,该团队对核糖开关传感器的特异性及灵敏性进行了实验。如图3所示,通过测定,绘制核糖开关法测定维生素B12的标准曲线,发现二者呈现负相关趋势,呈线性关系。同时测定了核糖开关传感器对其他类咕啉化合物反应,发现MCBL和OHCBL以相似的方式抑制GFP表达;ADCBL比CNCBL更能抑制GFP表达;CNCBL是最热稳定的形式(如图3),因此在使用核糖开关进行测定时,钴胺素要在含有KCN的乙酸盐缓冲液中进行加热,形成稳定的CNCBL,可高效且稳定的进行实验。文章中,核糖开关传感器对其他复合物反应同样进行实验(如图3),发现脱氧核糖核苷酸和光分解维生素B12不能关闭核糖开关传感器来抑制GFP表达;复合的钴胺素中,高浓度的IF-CNCBL(750 ng / mL)和HC-CNCBL(750 ng / mL)可关闭核糖开关传感器。核糖开关传感器可有效排除假性维生素,对钴胺素有高效的特异选择性。

图3. 核糖开关法测定维生素B12的标准曲线及其对其他复合物的反应

点评:

1. 核糖开关传感器检测维生素B12结果与HPLC相似。

2. 核糖开关的结果比微生物测定结果低23%,可有效排除微生物测定的假性结果。

3. 该方法对核酸和假维生素B12没有反应。

4. 灵敏度高,可在10-1000ng / mL的范围内测定。

5. 食品中多数维生素B12与蛋白质结合,不能检测到与蛋白质结合的维生素B12,实验中样品前处理方法不明确。

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Zhang Y, Chan P, Herr A. Rapid Capture and Release of Nucleic Acids through a Reversible Photo-cycloaddition Reaction in the Psoralen-functionalized Hydrogel [J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2018, 57(9).